技术专栏

1. 如何在采血过程中避免溶血？ 发生溶血的主要原因有： ① 机械性损伤：采血速度过慢或者过快、暴力混匀、针头过细（<22G）、反复采血； ② 操作不当：酒精未完全挥发采血、抽血时负压过大、血液注入采集管时冲击力过强； ③ 样本分离制备：长时间处理、过高的离心力或反复冻融样本； ④ 麻醉采血：使用了溶血作用的麻醉剂； 图1 人采血过程图和上清黄色部分的正常血清血浆颜色图   因此，我们有如下建议： ① 采血前：选择合适的采血针头，采血前确保酒精完全挥发；如果进行麻醉采血，建议使用无溶血作用的麻醉剂；

1. ELISA实验中为什么在制备组织匀浆和细胞提取液时建议使用蛋白酶抑制剂？ 在制备组织匀浆或细胞提取液时，组织或细胞内源性蛋白酶（如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等）会被释放，可能导致以下问题： ① 靶蛋白降解： 目的蛋白会被内源性蛋白酶降解，导致假阴性结果。 ② 蛋白片段干扰： 目的蛋白降解后产生的短肽可能会非特异性结合ELISA抗体，导致背景OD值升高。 如果不使用蛋白酶抑制剂，可能会导致： ① 假阴性结果： 降解导致靶蛋白的量减少，无法正确检测； ② 数据波动大、重复性差：样本中的蛋白降解程度不同，导致数据不一致； ③ 背景OD值升高：降解产物与抗体结合，产生

1. 在进行ELISA实验前，制备血浆样本可以使用哪些抗凝剂？ 在制备血浆时，可以使用EDTA盐抗凝剂，我们推荐EDTA2Na，浓度为1.5–2.2 mg/mL 血液，采血管预装量通常在 4.5 mL 血 + 7.2 mg EDTA2Na（即 1.6 mg/mL，适用于大多数检测）。也可以使用市面上其它的抗凝剂如肝素盐、柠檬酸盐等。以上盐通常为钠盐或者钾盐。若还需要进行生化/酶学检测，需预实验验证抗凝剂兼容性。 2. 如何制备血浆？ 使用含抗凝剂的采血管收集样品，样品收集后30分钟内于2-8℃，1000×g 离心 15分钟，取上清检测。

1. 为什么ELISA检测组织匀浆上清以及细胞提取液需要BCA总蛋白定量？ 答：① 减少误差：组织匀浆以及细胞提取液处理过程中的样本量和蛋白提取效率可能存在误差，BCA定量能确保样品中总蛋白浓度一致，从而提高ELISA结果的准确性；② 提高实验可靠性：BCA定量确保每个样品中总蛋白量相同，使得ELISA结果具有可比性和可靠性；③ 期刊要求：高水平期刊通常要求在实验中报告蛋白定量数据，以确保结果的科学性和重复性。因此，建议在进行ELISA实验时，先进行BCA总蛋白定量实验。 2. 检测组织匀浆上清以及细胞提取液时，是否需要将组织匀浆上清以及细胞提取液稀释到相同的浓度(ug/ul)再上

样本稀释方案  如果您的检测样本需要稀释且稀释倍数高，建议通用稀释方案参考如下： 稀释100倍：一步稀释。取5μL 样本到 495μL 标准品&样本稀释液内，做100倍稀释； 稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品&样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL20倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内， 做50倍稀释，总共稀释1000倍； 稀释100,000 倍：三步稀释。取5μL 样本到195μL标准品&样本稀释 液内，做40倍稀释，再取5μL40倍稀释

1. 特殊情况下的样本的处理 关于高脂样本：高脂样本含有脂肪，不是均质溶液，若直接上样会影响抗原抗体的结合，测值不准确。建议先大转速5000×g离心，静置10min后取中层较澄清液体，再用大转速(≥5000×g)离心一次取中下层清液用于检测。   关于溶血样本：样本溶血后，内源性HRP酶以及血红蛋白的类HRP性能会导致ELISA出现不可控的非特异性着色，从而影响检测结果的准确性。如果样本轻微溶血，在浓度范围允许的情况下，可以对样本进行稀释检测以减少其影响或者是进行离心取上清。如果溶血严重建议重新收集样本。   2. 需要破碎的样本处理方式 细胞提取液：：贴壁